Le fasi della sperimentazione preclinica: la ricerca in vitro e in silico

Vi siete mai chiesti quale sia il percorso che segue un farmaco dalla sua ideazione all’acquisto in farmacia?

Per motivi di sicurezza e salute pubblica, una nuova molecola non può essere testata direttamente sull’uomo. La ricerca, dunque, si avvale di diversi tipi di sperimentazione, suddivisi in diverse fasi, e viene effettuata prima in laboratorio e su modelli animali (sperimentazione preclinica) e poi sull’uomo (sperimentazione clinica).

A differenza della sperimentazione clinica, quella preclinica ha lo scopo di scoprire come si comporta e qual è il livello di tossicità della molecola da cui si ricaverà il farmaco, su un organismo vivente complesso, nonché capire come verrà somministrato il farmaco (via di somministrazione), assorbito dall’organismo e successivamente come verrà eliminato (farmacocinetica). La sostanza studiata può agire a diversi livelli: da quello molecolare, a quelli cellulare od organico.

Ad oggi esistono due diversi modi di studiare questi processi:

• metodi biologici (divisi a loro volta in esperimenti in vitro e in vivo)
• metodi in silico

Oggi vedremo più da vicino come funzionano i metodi in vitro e in silico.

Cos’è la sperimentazione in vitro e come funziona

Gli esperimenti in vitro non richiedono l’utilizzo di un organismo “intero”, questo vuol dire che la ricerca può essere effettuata al di fuori del corpo umano senza la necessità di somministrare il farmaco a una persona che volontariamente si sottopone allo studio. La sperimentazione in vitro viene usata per:

• verificare se la molecola che costituisce principalmente il farmaco possieda le proprietà terapeutiche che le sono state attribuite nelle analisi preliminari;
• testare eventuali modifiche della molecola per aumentarne l’efficacia o la sicurezza;
• provare che la molecola non sia tossica per l’uomo

La sostanza viene messa in provetta insieme a tessuti, colture cellulari o a microrganismi isolati e sottoposta a una serie di test, eseguiti in laboratori altamente specializzati.

Da dove vengono prese queste componenti così utili per il progresso scientifico?

Esistono due tipi di fonti.

1. La prima è costituita dalle biobanche, luoghi in cui vengono raccolti, processati, conservati e distribuiti campioni biologici umani e animali.
2. La seconda consiste nel prelievo di cellule malate dal sangue o da una biopsia (l’asportazione chirurgica di un tessuto per effettuare la diagnosi) da un paziente

Nella sperimentazione in vitro in realtà il materiale più importante è costituito dalle colture cellulari. Le cellule vengono isolate e separate dal loro ambiente abituale e fatte crescere in sostanze che assomigliano all’organismo da cui sono state prese. Le colture cellulari utilizzate oggi dai ricercatori si sono evolute nel tempo; infatti negli anni sono state sviluppate nuove tecniche per renderle sempre più efficienti, ad esempio usando antibiotici nel terreno di coltura per evitare contaminazioni esterne o migliorando le tecniche e la strumentazione. Le cellule dunque crescono in una fiasca di plastica, contenente un liquido pieno di nutrienti (chiamato brodo di coltura), a cui viene aggiunta la molecola da studiare. In questo modo i ricercatori potranno osservare, tramite un microscopio (trattandosi ovviamente di componenti piccolissime) in che modo il futuro farmaco agirà sul gruppo di cellule analizzate. Questi ambienti controllati in cui vengono fatte crescere le cellule simulano il più fedelmente possibile quello che succederebbe al nostro corpo se assumessimo quel farmaco.

Una volta osservato e studiato come queste cellule reagiscono, si identifica la molecola più interessante che va, però, successivamente testata anche in altri modelli e ambiti, prima che la stessa possa divenire farmaco. Per esempio, sono necessari ulteriori studi su un insieme sempre più numeroso di cellule che derivano da altre “fonti” rispetto a quelle inizialmente utilizzate nel progetto di studio (ad esempio cellule che vengono da biobanche o donatori diversi).

Vantaggi della sperimentazione in vitro

La sperimentazione in vitro consente di studiare in modo specifico diversi aspetti della funzione cellulare. Ci permette di osservare l’effetto che quella molecola crea indipendentemente dal contesto ambientale, ovvero l’organismo, il tessuto e l’organo all’interno del quale le cellule risiedono normalmente. Il vantaggio più grande di questa tipologia di sperimentazione preclinica è la facilità e la velocità con la quale è possibile studiare effetti specifici e diretti.

Svantaggi della sperimentazione in vitro

Il corpo umano viene definito come un sistema complesso, in cui le interazioni e le risposte cellulari non seguono degli schemi lineari ma sono imprevedibili. I modelli in vitro quindi, sebbene diano una prima visione di quelle che potrebbero essere le risposte dell’organismo al farmaco, non riescono a riprodurre la complessità del corpo umano, poiché si tratta di supervisionare delle cellule estrapolate dal corpo, che non comunicano con le altre presenti nell’organismo e si trovano in una condizione quasi ideale (cosa che non sempre è presente in un organismo). Questa modalità di sperimentazione, dunque, potrebbe non tenere conto delle interazioni tra le cellule e degli innumerevoli processi biochimici che si verificano durante la “vita” della molecola (ad esempio come questa viene assorbita, distribuita, metabolizzata e espulsa dall’organismo). È quindi possibile che l’attività farmacologica osservata non sia del tutto simile alla situazione in vivo (ovvero su organismi viventi come gli animali).

In sintesi gli studi in vitro tendono a essere troppo riduzionisti e semplicistici, mentre la situazione in vivo è spesso complessa e richiede analisi più approfondite . Per tutti questi motivi infatti la sperimentazione non si ferma mai al solo metodo in vitro, ma si rende necessario passare in seguito alla sperimentazione in vivo.

Esempi in letteratura di sperimentazione in vitro

Nonostante oggi si sappia molto su questo metodo è importante per la scienza continuare ad andare avanti con la sperimentazione. Come ci dice Raunio e colleghi, lo studio di come un farmaco “viaggiava” e si comportava all’interno del corpo umano (come veniva assorbito, distribuito ecc.) poteva essere valutato solo con studi in vivo. Oggi invece grazie a studi in vitro più avanzati è possibile conoscere il viaggio del farmaco anche non usando organismi viventi. Possiamo citare qualche esempio di utilizzo della sperimentazione in vitro. Tetyana Valeriyivna Denysko e colleghi, hanno condotto recentemente uno studio molto interessante. A causa della crescente resistenza agli antibiotici si è reso necessario cercare nuovi antisettici contro le infezioni da ferite da combattimento (come la decametossina). In questo studio il materiale biologico infetto da mettere a contatto con i nuovi antisettici è stato prelevato da pazienti con complicanze dovute all’infezione. Si è visto come, grazie a questi farmaci, la crescita batterica diminuisse notevolmente.

In vitro evaluation of the antimicrobial activity of antiseptics against clinical Acinetobacter baumannii strains isolated from combat wounds, Front. Microbiol., 04 October 2022, Sec. Antimicrobials, Resistance and Chemotherapy

Cos’è la sperimentazione in silico e come funziona

Nella sperimentazione in silico (il silicio è la sostanza di cui sono fatti i componenti elettronici dei computer) viene utilizzato unicamente il computer. Questo vuol dire che il ricercatore si avvale di un aiuto informatico e di simulazioni matematiche, senza sperimentare fisicamente in provetta o su un essere vivente. Anche in questo campo esistono delle banche dati on-line, in cui vengono raccolti modelli di proteine, geni e altre componenti che i ricercatori scelgono e combinano a seconda delle necessità. Inoltre possono visualizzare tridimensionalmente tutto ciò che accade durante i processi. In campo farmaceutico, ad esempio, il ricercatore, grazie a dei complessi software matematici, può prevedere, senza bisogno di sperimentarlo, come quel farmaco circolerà e si distribuirà nell’ambiente cellulare basandosi solamente su dei dati preesistenti.

Vantaggi della sperimentazione in silico

I vantaggi sono molti:

1. il primo vantaggio è costituito dalla velocità con cui queste ricerche vengono condotte.
2. Il secondo vantaggio è di natura economica, poiché si utilizza solo un computer.
3. Il terzo vantaggio è che, grazie all’informatica, si possono raccogliere e conservare milioni e milioni di dati, che in un archivio fisico sarebbe impossibile catalogare.
4. Il quarto vantaggio invece è costituito dal fatto che questo metodo può essere applicato senza che la molecola o il composto necessario allo studio sia fisicamente disponibile, evitando così esperimenti su animali o esseri umani.

Svantaggi della sperimentazione in silico

Nonostante lo studio in silico possa sembrare un metodo all’avanguardia e sostenibile, dobbiamo sempre ricordare il concetto espresso per gli studi in vitro: la complessità dell’essere umano. Basti pensare semplicemente che una cellula isolata dall’ambiente che la circonda (nelle riproduzioni al computer) si comporterà in modo diverso trovandosi a contatto con altre cellule. Come si può dunque simulare in maniera precisa e puntuale la reazione del corpo a una sostanza? Questo è il grande limite di questa tipologia di sperimentazione pre-clinica.

Esempi in letteratura di sperimentazione in silico

Navigando su PubMed (un servizio di ricerca gratuito di letteratura scientifica biomedica) si trovano ad oggi revisioni molto recenti sulla sperimentazione in silico. Citiamo lo studio di Eric J Duncavage e colleghi, in cui vengono esplorati tutti gli aspetti di questa sperimentazione, i limiti, i punti di forza e le applicazioni nel campo della patologia molecolare. I campi dove questo tipo di sperimentazione può essere usata sono ancora oggetto di studio, infatti gli autori alla fine ipotizzano e cercano di immaginare gli scenari futuri.

Conclusioni

Questi metodi e i loro risultati vanno confrontati e confermati sempre con studi sugli esseri viventi. Tuttavia, è importante comprendere che ciascuna modalità è di supporto all’altra. Infatti, raramente in biologia e in medicina è possibile parlare di metodi e di modelli alternativi, poiché questi saranno sempre complementari. Sono pochissime, infatti, le situazioni interamente valutabili al computer, tuttavia il supporto informatico è di grande aiuto per organizzare, analizzare e interpretare i dati sperimentali. E ancora, è difficile che un problema biologico o farmacologico possa essere affrontato in maniera completa usando solo modelli in vitro o in vivo.

Fonti:

• https://www.aifa.gov.it/sperimentazione-clinica-dei-farmaci
• https://www.treccani.it/enciclopedia/modelli-sperimentali-nella-ricerca-biomedica_%28Enciclopedia-della-Scienza-e-della-Tecnica%29/
• https://magazine.x115.it/x115/studi-in-vitro/#:~:text=La%20sperimentazione%20in%20vitro%20viene,attribuite%20nelle%20analisi%20preliminari*%3B
• https://www.biopills.net/colture-cellulari/#:~:text=Le%20colture%20cellulari%20sono%20il,ambiente%20di%20origine%20della%20coltura
• Raunio H, Taavitsainen P, Honkakoski P, Juvonen R, Pelkonen O. In vitro methods in the prediction of kinetics of drugs: focus on drug metabolism. Altern Lab Anim. 2004 Oct;32(4):425-30. doi: 10.1177/026119290403200415. PMID: 15651928.
• Denysko TV, Nazarchuk OA, Gruzevskyi O, Bahniuk NÀ, Dmytriiev DV, Chornopyschuk RM, Bebyk VV. In vitro evaluation of the antimicrobial activity of antiseptics against clinical Acinetobacter baumannii strains isolated from combat wounds. Front Microbiol. 2022 Oct 4;13:932467. doi: 10.3389/fmicb.2022.932467. PMID: 36267170; PMCID: PMC9577188.
• https://medicalpharmanews.com/it/studi-clinici-in-silico/
• M. d’Incalci, L. Vozza, Come nascono le medicine La scienza imperfetta dei farmaci, Chiavi di lettura, Zanichelli, 2014
• Duncavage EJ, Coleman JF, de Baca ME, Kadri S, Leon A, Routbort M, Roy S, Suarez CJ, Vanderbilt C, Zook JM. Recommendations for the Use of In silico Approaches for Next Generation Sequencing Bioinformatic Pipeline Validation: A Joint Report of the Association for Molecular Pathology, Association for Pathology Informatics, and College of American Pathologists. J Mol Diagn. 2022 Oct 13:S1525-1578(22)00287-2. doi: 10.1016/j.jmoldx.2022.09.007. Epub ahead of print. PMID: 36244574.